Phân loại một số chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện

Bùi Thị Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 159 - 165 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 159 PHÂN LOẠI MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG VI SINH VẬT GÂY NHIỄM TRÙNG BỆNH VIỆN Bùi Thị Hà* Trường Đại học Y Dược – ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Trong số các chủng xạ khuẩn đã phân lập từ đất của tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành sàng lọc nhiều lần và tuyển chọn đƣợc 2 chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất là A1, T2. Cả hai chủng này có khả năng kháng các vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện là Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus. Sau đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại hai chủng xạ khuẩn này dựa theo chƣơng trình xạ khuẩn quốc tế ISP. Kết quả cho thấy chủng A1 là một chủng xạ khuẩn thuộc loài Streptomyces kursanovii. Chủng T2 là một chủng xạ khuẩn thuộc loài Streptomyces cinereoruber subsp. cinereoruber. Từ khóa: Xạ khuẩn, Chủng, Hoạt tính kháng sinh, Phân loại, Môi trường.  ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là nƣớc có tỷ lệ bệnh nhiễm trùng khá cao, dẫn đến nhu cầu về thuốc kháng sinh là rất lớn. Nhƣng hiện nay chƣa có nhà máy sản xuất kháng sinh vì vậy hàng năm vẫn phải nhập khẩu một lƣợng lớn thuốc kháng sinh. Để đáp ứng nhu cầu đó, từ lâu Đảng và Nhà nƣớc ta đã quan tâm đến hƣớng sản xuất chất kháng sinh để đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho nhân dân. Ngoài việc chữa bệnh trong thực tế còn tồn tại một vấn đề nữa cũng cần đƣợc giải quyết là hiện tƣợng nhiễm trùng bệnh viện – là việc ngƣời bệnh bị nhiễm thêm một hoặc một số vi khuẩn trong khi đang điều trị tại bệnh viện. Theo nhiều nghiên cứu tại các bệnh viện ở Việt Nam cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện là 19,1%, tỷ lệ này còn tăng lên nếu bệnh nhân nằm viện kéo dài [6]. Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách cùng với việc kiểm soát nhiễm trùng chƣa tốt đã dẫn tới tình trạng kháng thuốc và nhiễm trùng bệnh viện đang gia tăng đến mức độ đáng lo ngại. Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus là hai trong số các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện hàng đầu. Chúng là nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp của hàng loạt các  Tel: 01683 566.336, Email: buihayk@gmail.com bệnh nhiễm khuẩn: viêm phổi, viêm phế quản, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng huyết, nhiễm khuẩn vết mổ Đồng thời, tỷ lệ kháng kháng sinh của hai chủng này ngày càng tăng cao. Với mong muốn đóng góp một phần kiến thức vào việc giải quyết vấn đề trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn và phân loại một số chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện”. MỤC TIÊU - Tuyển chọn đƣợc một số chủng xạ khuẩn mạnh nhất có khả năng đối kháng vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh mạnh. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn. - Các chủng vi sinh vật kiểm định (Streptoccocus aureus và Pseudomonas aeruginosa) do Bệnh viện ĐKTƢ Thái Nguyên cung cấp. Phương pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học. Bùi Thị Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 159 - 165 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 160 - Phƣơng pháp định loại theo chƣơng trình xạ khuẩn quốc tế ISP. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ tháng 1/ 2010 đến tháng 12/ 2010. Địa điểm: Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và Phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học Công nghệ Việt Nam. Chỉ tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn. - Phân loại 2 chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn theo phƣơng pháp truyền thống. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học Các đặc điểm hình thái Chủng A1 có cuống sinh bào tử dạng xoắn (S), bề mặt bào tử nhẵn, có khoảng 19 - 20 bào tử trên 1 chuỗi. Chủng T2 có cuống sinh bào tử dạng thẳng (RF), bề mặt bào tử nhẵn, số lƣợng bào tử trên 1 chuỗi là 20 - 45. Đặc điểm về cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử của 2 chủng xạ khuẩn đƣợc thể hiện trong hình 1 và hình 2. Chủng A1 Chủng T2 Hình 1. Hình dạng cuống sinh bào tử 2 chủng xạ khuẩn A1 (X10.000) A1 (X15.000) Bùi Thị Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 159 - 165 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 161 T2 (X5000) T2 (X15000) Hình 2. Hình dạng bề mặt bào tử 2 chủng xạ khuẩn Bảng 1. Đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng xạ khuẩn MT Chủng XK Sinh trưởng Màu KTCC Màu KTKS Sắc tố ISP1 A1 + Trắng Trắng 0 T2 ++ Trắng xám Xám 0 ISP3 A1 +++ Trắng Trắng Vàng nhạt T2 +++ Xám Xám 0 ISP4 A1 ++ Trắng Vàng 0 T2 + Trắng Vàng 0 ISP5 A1 ++ Trắng Vàng 0 T2 ++ Trắng xám Ghi Đen nâu ISP6 A1 + Trắng Xám 0 T2 + Trắng Xám Đen Gause I A1 +++ Xám nhạt Trắng sữa Vàng T2 +++ Xám nhạt Trắng Vàng Gause II A1 + Nâu nhạt Trắng Vàng T2 + Đen Trắng Nâu MT 79 A1 ++ Trắng Trắng 0 T2 + Nâu Trắng Vàng nâu +++ Sinh trưởng tốt ++ Sinh trưởng bình thường + Sinh trưởng yếu - Không sinh trưởng Các đặc điểm nuôi cấy *Khả năng sinh trưởng, màu sắc KTCC, KTKS, sắc tố tan Trên các môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau, các chủng xạ khuẩn thể hiện sự khác nhau về khả năng sinh trƣởng, màu sắc KTCC, KTKS và sắc tố tan. Các đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng xạ khuẩn đƣợc thể hiện trong bảng 1. Cả 2 chủng xạ khuẩn đều có khả năng mọc tốt trên môi trƣờng Gauss I, nhƣng mọc kém trên MT ISP 6. Trên các MT còn lại, sự sinh trƣởng của xạ khuẩn đạt mức bình thƣờng. * Sự hình thành melanin Bùi Thị Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 159 - 165 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 162 Hình 3. Khả năng hình thành melanin của 2 chủng Khả năng hình thành melamin đƣợc chú ý nhiều trong phân loại học. Xạ khuẩn đƣợc nuôi trên MT ISP - 6 ở nhiệt độ phòng. Nếu các chủng có khả năng sinh melamin thì chúng sẽ làm đổi màu môi trƣờng từ vàng nhạt --> nâu đậm --> đen. Dựa theo những số liệu thu đƣợc thì trong 2 chủng xạ khuẩn kể trên chỉ có chủng T2 có khả năng hình thành melanin, chủng A1 không có khả năng này. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa * Khả năng sinh enzym ngoại bào Kết quả thử hoạt tính enzyme cellulase, amilase và protease của 2 chủng xạ khuẩn đƣợc cho trong bảng 2. Kết quả cho thấy cả 2 chủng đều có khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào: amilase, cellulase và protease. Nhìn chung, hoạt tính enzyme của chủng A1 đều mạnh hơn của chủng T2. Với việc cả 2 chủng xạ khuẩn đều có hoạt tính cellulase và amilase thì đây thực sự là điểm đáng lƣu ý bởi khi nuôi cấy chúng trên quy mô công nghiệp thì chúng ta có thể tận dụng những nguồn cacbon thô, rẻ tiền và sẵn có trong nƣớc. Bảng 2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 2 chủng xạ khuẩn Chủng Hoạt tính enzyme của 2 chủng XK A1 và T2 (D-d, mm) Amilase Cellulase Protease A1 20,33 ± 0,58 20,33 ± 0,89 19,67 ± 0,89 T2 18,67 ± 0,58 18,33 ± 0,89 19,47 ± 0,89 Bảng 3. Khả năng chịu muối của 2 chủng nghiên cứu Nồng độ ( % ) A1 T2 0 ++ +++ 0,5 ++ ++ 1 ++ + 3 ++ + 5 + + 7 + - 9 + - 11 - - 12 - - Ghi chú: +++ Sinh trƣởngtốt ++ Sinh trƣởng bình thƣờng + Sinh trƣởng yếu - Không sinh trƣởng * Khả năng chịu muối Các chủng nghiên cứu đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Gauss -1 có bổ sung NaCl ở các nồng độ dao động từ 0,5 - 12 %. Sau 5 ngày nuôi cấy, kết quả về sự sinh trƣởng của các chủng đƣợc thể hiện trong bảng 3. Dữ liệu nghiên cứu cho thấy: khả năng chịu muối của 2 chủng xạ khuẩn có sự khác biệt nhau. T2 chịu đƣợc nồng độ muối 5%, trong khi A1 có thể sống trong môi trƣờng có nồng độ muối 9%. Điều này chứng tỏ A1 là một chủng ƣa mặn. * Khả năng đồng hóa các nguồn đường khác nhau Khả năng sử dụng nhiều nguồn đƣờng (nguồn cacbon) khác nhau rất có ý nghĩa trong quá trình lên men công nghiệp. Khi ấy ta có thể tận dụng nhiều nguồn đƣờng thay thế nhằm làm giảm chi phí lên men. Trong thí nghiệm của mình, chúng tôi tiến hành nuôi 2 chủng A1; T2 trên MT ISP -9 có bổ sung 1% các nguồn đƣờng khác nhau. Sau 14 ngày nuôi, kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 4 và hình 4. Bảng 4. Khả năng sinh trƣởng của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng có nguồn đƣờng (cacbon) khác nhau Nguồn cacbon Mức độ sinh trưởng A1 T2 Bùi Thị Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 159 - 165 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 163 Không đƣờng - - Arabinose ++ ++ Cellulose - - Fructose ++ ++ Glucose ++ + Inositol +++ ++ Lactose +++ +++ Maltose + +++ Raffinose + ++ Ghi chú: +++ Sinh trƣởng tốt ++ Sinh trƣởng bình thƣờng + Sinh trƣởng yếu - Không sinh trƣởng Hình 4. Sự sinh trƣởng của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng có nguồn cacbon khác nhau Bảng 5. So sánh đặc điểm phân loại của chủng A1 với loài Streptomyces kursanovii Đặc điểm Xạ khuẩn A1 Streptomyces kursanovii Cuống sinh bào tử Xoắn Xoắn Bề mặt bào tử Nhẵn Nhẵn Môi trƣờng Gauze 1 Hệ sợi khí sinh Xám Xám Hệ sợi cơ chất Vàng Vàng hơi đậm hoặc vàng cam Sắc tố Vàng Giống màu KTCC, đôi khi không có Môi trƣờng Gauze 2 Hệ sợi khí sinh Ghi xám Vàng đến ghi Hệ sợi cơ chất Vàng Vàng đến vàng nâu Sắc tố Vàng Vàng Môi trƣờng Glycerin Nitrat Hệ sợi khí sinh Vàng Vàng Hệ sợi cơ chất Vàng đậm Vàng đậm Sắc tố Vàng Vàng Môi trƣờng Sắt - Nấm men - Peptone Sinh tổng hợp Melanoid Không sinh Melanoid Có sinh Melanoid Sinh tổng hợp các chất kháng sinh Ostreogrisine, Fumaramycine Môi trƣờng đại mạch Hệ sợi khí sinh Vàng Vàng Hệ sợi cơ chất Vàng đậm Vàng đậm đến vàng cam Sắc tố Vàng Vàng Phân loại hai chủng xạ khuẩn * Chủng A1 Bùi Thị Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 159 - 165 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 164 So sánh với mô tả của Gauze và cộng sự, chủng xạ khuẩn A1 giống với xạ khuẩn Streptomyces kursanovii (Preobrazhenskaya et al, 1957 và Pridham, 1958): Kết luận: Nhƣ vậy chủng A1 là một chủng xạ khuẩn thuộc loài Streptomyces kursanovii. Chủng này giống các chủng phân loại nhƣ sau: ATCC 15824 (Bộ sƣu tập giống chuẩn Mỹ); ISP 5162 (Dự án xạ khuẩn quốc tế), RIA 1054 (Viện nghiên cứu khoa học kháng sinh liên bang Liên Xô cũ) * Chủng T2 So sánh với mô tả của Gauze và cộng sự, chủng xạ khuẩn T2 giống với xạ khuẩn Streptomyces cinereoruber subsp. cinereoruber (Corbaz et al, 1957c). Kết luận: Nhƣ vậy, chủng xạ khuẩn T2 có thể xem là một chủng xạ khuẩn thuộc loài Streptomyces cinereoruber subsp. cinereoruber. Chủng này giống các chủng phân loại nhƣ sau: RIA535 (Viện nghiên cứu khoa học kháng sinh liên bang Liên Xô cũ), ATCC 19740 (Bộ sƣu tập giống chuẩn Mỹ), ISP 5012 (Dự án xạ khuẩn quốc tế). KẾT LUẬN Từ những kết quả đã thu đƣợc chúng tôi rút ra những kết luận sau: - Đã tuyển chọn đƣợc 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất có khả năng kháng 2 chủng vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện. - Nghiên cứu đƣợc đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm sinh lý sinh hóa của hai chủng xạ khuẩn đã chọn. - Phân loại đƣợc chủng A1 là một chủng xạ khuẩn thuộc loài Streptomyces kursanovii. Chủng T2 là một chủng xạ khuẩn thuộc loài Streptomyces cinereoruber subsp. cinereoruber Bảng 6. So sánh đặc điểm phân loại của chủng T2 với loài Streptomyces cinereoruber subsp. Cinereoruber Đặc điểm Xạ khuẩn T2 Streptomyces cinereoruber subsp. cinereoruber Cuống sinh bào tử Thẳng Thẳng Bề mặt bào tử Nhẵn Nhẵn Môi trƣờng Gauze 1 Hệ sợi khí sinh Trắng Xám Hệ sợi cơ chất Không màu Tím hồng Sắc tố Không màu Tím hồng Môi trƣờng Gauze 2 Hệ sợi khí sinh Xám Xám Hệ sợi cơ chất Nâu thẫm Nâu đến nâu thẫm Sắc tố Nâu Nâu, mất dần Môi trƣờng Glycerin Nitrat Hệ sợi khí sinh Nâu xám Kem, nâu xám Hệ sợi cơ chất Đỏ sẫm Đỏ sẫm Sắc tố Đỏ Đỏ Môi trƣờng Sắt - Nấm men - Peptone Sinh tổng hợp Melanoid Có sinh Melanoid Có sinh Melanoid Môi trƣờng Đại mạch Hệ sợi khí sinh Xám Không mô tả Hệ sợi cơ chất Xám Không mô tả Sắc tố Không Không mô tả Sinh tổng hợp các chất kháng sinh Rhodomycine . KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục phân loại 2 chủng xạ khuẩn theo phương pháp sinh học hiện đại. 2. Tiếp tục nghiên cứu bản chất hóa học của kháng sinh tách chiết từ các chủng xạ khuẩn. 3. Tiếp tục nghiên cứu tinh chế chất kháng sinh và khả năng ứng dụng của chúng trong đời sống. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Thị Hà Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 86(10): 159 - 165 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 165 [1]. Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Trung tâm khoa học Tự nhiên và công nghệ Quốc gia, Hà Nội. [2]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phƣớc, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2, Nxb KHKT, Hà Nội. [3]. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội. [4]. Đỗ Thu Hà (2006), Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn QN – 29 và ĐN – 110 phân lập từ đất khu vực Quảng Nam – Đà Nẵng, Tạp chí Di truyền học, Hà Nội. [5]. Trần Ðình Tuấn, Ðào Xuân Vinh, Nguyễn Thị Tuyết Vân và Cs, (2002), „‟Tìm hiểu độ nhạy cảm với kháng sinh của một số chủng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và trực khuẩn mủ xanh Pseudomononas aeruginosa phân lập tại Đak Lak năm 2000 „‟, Hội nghị khoa học công nghệ tuổi trẻ các trƣờng ĐH Y Dƣợc Việt Nam lần thứ 11. [6]. Hoàng Kim Tuyến, Vũ Kim Cƣơng, Đặng Mỹ Hƣơng, (2005), „‟Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập tại bệnh viện Thống Nhất (từ 8/2002 – 8/2005)". [7]. Annaliesa S. Anderson, Elizabeth M.H. Wellington (2001), “The taxonomy of Streptomyces and related genera”, International Journal of Systematic and Evolution Microbiology, 51, 797 – 814. [8]. Joachim M. Wink. „‟Method for taxonomic description of the actinobacteria‟‟ www.dsmz.de/microorganisms/files/Methods.pdf [9].Kyung Man You, Yong Keun Park (1996), “A new method for the selective isolation of actinomycetes from soil”. Biotechnology techniques Korea, Vol10, No7 [10]. Shirling E.B, Gotilieb D. (1966), " Methods for characterization of Streptomyces species", International Journal of Systematic Bacteriolog, Vol 16, No 3, 313 – 340. [11]. Shu-Kun Tang, Wen-Jun Li, Wang Dong, Yong-Guang Zhang, Li-Hua Xu, Cheng-Lin Jiang (2002), “Study of the Biological Characteristic of some Halophilic and Halotolerant actinomycetes isolated from saline and alkaline soils”, Actinomycetol, Vol17, No 1. SUMMARY CLASSIFYING SOME ACTINOMYCETE STRAINS WHICH ARE RESISTANT MICROORGANISMS CAUSING INFECTIONS AT HOSPITAL Bui Thi Ha  College of Medicine and Pharmacy -TNU Of actinomycete strains isolated from the land of Thai Nguyen province, we selected the two strains have strongest effected antibiotic including A1, T2 with several refinements - both strains were resistant microorganisms causing nosocomial infection namely Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. After that, we conducted research on the biological characteristics and classified two strains of this actinomycete actinomycete program based on international ISP. The results showed that strain A1 was an actinomycete strain of the species- Streptomyces kursanovii. T2 was a strain of the species Streptomyces cinereoruber subsp. Cinereoruber. Key words: Actinomyces, Strain, Antibiotic activity, Classification, Medium.  Tel: 01683 566.336, Email: buihayk@gmail.com